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长爪沙鼠是一种“多功能”实验动物，由于一些与人类相似的特殊解剖结构、微生物易感性、肿瘤和代谢性疾病的自发性和高发性，使其广泛应用于视觉、听觉、脑血管疾病、癫痫、病原体感染、肿瘤和代谢疾病的研究。

例如，与大、小鼠相比，长爪沙鼠的昼行性、敏锐的明视力、含有13%的视锥细胞以及与人类视网膜更相似的解剖学结构，使其应用于视网膜生理功能的研究和视网膜损伤的治疗药物的开发^{[5, 6]}。此外，由于长爪沙鼠具有与人类相似的低频率声音高敏感性，长爪沙鼠成为研究正常和听力受损情况下听觉处理神经基础的动物模型之一，并常用于听觉通路结构和功能的研究，如中耳和内耳功能、听觉脑干的双耳处理和年龄相关的听觉损失等^[7-9]。长爪沙鼠全基因组测序也显示，6个听觉细胞和神经元存活关键蛋白在沙鼠和小鼠之间的保守性为97.37%~100%，进一步证明沙鼠是研究听力的理想模型之一。

长爪沙鼠广泛应用于脑血管疾病研究。研究表明，野生型长爪沙鼠群体具有30~40%个体存在脑底动脉Willis环（circle of Willis，CoW）变异缺失，且存在不同变异缺失类型。这一特性和比率都与人类高度相似，在西方和中国人群中正常结构CoW的比例分别只有42-52％和27％。在中国人群中，完全性前交通动脉（complete anterior communicating arteries，ACoAs）比例为79％，完全后交通动脉（complete posterior communicating arteries，PCoAs）比例为31％。而在我们建立的长爪沙鼠脑缺血高发近交系封闭群中，50％沙鼠缺失ACoAs，75％沙鼠缺失PCoAs，在我们培育的近交系沙鼠中，ACoAs和PCoAs缺失比例分别达到88.89％和100％，而且这种CoW变异是可遗传的^{[10, 11]}。因此长爪沙鼠是研究脑血管发育和颈动脉结扎建立脑缺血模型的理想动物，并被广泛应用于脑缺血疾病机制和药物开发的研究^{[10, 12]}。

长爪沙鼠易发癫痫，10-20%个体在噪音、抓取或突然下降等简单刺激下即可癫痫发作。研究人员利用沙鼠癫痫发作模型，揭示沙鼠海马中γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）（A）受体而非GABA（B）受体的差异分布可能是导致癫痫自发和重复性发作的潜在机制^[13]。基于沙鼠的这些特性，目前研究人员已培育了多种具有不同表型的癫痫易发近交系长爪沙鼠。

长爪沙鼠对多种病原体易感且病程与人类相似。长爪沙鼠广泛应用于幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染和致病机制研究。许多研究表明H.pylori感染的沙鼠发生了胃炎、胃溃疡、肠上皮化生、甚至胃癌，这与H.pylori感染人类的疾病进程相似^[16]。而在正常状态下，小鼠虽然也对H.pylori敏感，但很少发生胃癌，大鼠则很难感染H.pylori^[18]。因此，长爪沙鼠是研究H.pylori感染、其诱发胃癌的发病机制和治疗的理想啮齿动物模型。魏等发现H.pylori感染诱发的p53失调可能是胃癌风险增加的潜在机制^[17]；Rieder G等发现H.pylori IV型分泌系统（type IV secretion system，T4SS）和细胞菌素相关蛋白（cytotoxin-associated protein，CagA）是胃癌进展的主要危险因素；Sierra JC等人发现抑制表皮生长因子受体（epidermal growth fac tor receptor，EGFR）下调H.pylori感染诱导的胃上皮炎症反应、DNA损伤和胃癌，这提示EGFR抑制剂可用于预防H.pylori感染个体胃癌发展。此外，由于高感染率和疾病症状的相似性，沙鼠也广泛用于建立多种寄生虫感染和病毒感染动物模型。例如，长爪沙鼠周期性马来蠕虫的诱发感染率为74％，与人类自然状态诱发感染率相似。利用线虫感染的沙鼠，研究人员可以进行淋巴丝虫病的血清学试验和治疗方案研究。

长爪沙鼠也是研究肿瘤、糖尿病和肥胖等疾病的良好研究模型。多篇文献报道，老年长爪沙鼠存在一定比例的自发肿瘤，如肾上腺皮质、子宫癌、卵巢癌、皮肤癌和颗粒细胞癌等，在3年以上的长爪沙鼠中肿瘤发生率可达38.6%，这在大多数物种中是罕见的^{[14, 15]}。沙鼠还对胆固醇敏感，喂食高胆固醇饮食会导致沙鼠血浆总胆固醇迅速升高并伴随肝脏和肾上腺皮质的大量脂肪沉积，而在相同条件下，大、小鼠血浆脂质水平则无显著变化。此外，Boquist L发现在正常饮食的长爪沙鼠具有高血糖和肥胖特征的沙鼠^[19]。有意思的是，Boquist L发现，正常饮食的长爪沙鼠具有一定比例自发高血糖和肥胖^[20]。多项研究表明，沙鼠的这种自发性糖尿病表型是可遗传的。基于以上特征，我们利用原有的长爪沙鼠封闭群也筛选培育并建立了具有高自发率II型糖尿病（type II diabetes mellitus，T2DM）的近交系长爪沙鼠，随近交代数的增加沙鼠空腹和餐后血糖水平逐渐升高。而且，P.obesus和长爪沙鼠基因组测序都显示，调节胰岛功能的关键基因胰岛素调节同源框基因Pdx1（Pancreatic duodenal homeobox-1，胰岛素促进因子-1）具有GC偏向的突变，这可能影响了该基因调节胰岛素和其他胰腺基因的转录能力，从而导致沙鼠具有糖尿病易感性。因此，沙鼠是研究肿瘤和代谢性疾病的重要模型动物。

斯贝福转基因平台主任王妍具有多年长爪沙鼠研究经验，并在沙鼠基因敲除模型制备及沙鼠的脑缺血、严重脑损伤等方面发表相关论文。

原文链接：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32733872/

文章解析：

1. 基因敲除沙鼠制作实验流程的优化

制作CRISPR / Cas9诱导的基因敲除沙鼠的超排卵和胚胎移植的最佳程序如下：向6周龄的雌性沙鼠腹腔注射10 IU eCG，70小时后腹腔注射10 IUhCG，然后立即与3月龄以上雄性沙鼠合笼。hCG注射后17 h后收集合子，hCG注射后22 h进行显微注射。为了制备假孕沙鼠，向10-12周龄的雌性沙鼠腹腔注射10 IU eCG，70小时后腹腔注射10 IU hCG，然后立即与结扎的雄性沙鼠合笼，次日上午用托盘检查阴道栓，然后将20-22个受精卵移植到假孕沙鼠的单侧输卵管中。

2. 通过细胞质显微注射sgRNA和Cas9蛋白产生胱抑素C基因敲除（Cst3 - KO）和载脂蛋白A-II基因敲除（Apoa2- KO）沙鼠

Cst3 基因的两个gRNA 同在一个外显子上，为了避免彼此之间相互抑制，我们选择使用单个gRNA 进行注射。最终实验方案为胞质注射：gRNA 为50ng/μL、Cas9 蛋白质为32 ng/μL。结果显示，Cst3-E1-1未实现Cst3 基因突变，Cst3-E1-2成功诱导长爪沙鼠Cst3 基因Indels。Cst3-E1-2注 射后一共获得了 20只F0代沙鼠，其中有11只显示Cst3 基因缺失，敲除成功率为55%。对目的基因位点进行特异性扩增显示双条带或者条带大小改变，并进行Sanger测序显示有双峰或序列改变，表明其为杂合子或纯合子Cst3 基因缺失。对F0代沙鼠的基因型进行TA 克隆测序，各个体的基因型结果汇总见图1.5C。使用在线工具预测Cst3 基因突变后氨基酸序列并与正常沙鼠CST3 蛋白质序列比对，结果发现不论是2 bp 还是11 bp 缺失都会导致氨基酸序列的截短，氨基酸序列 长度由自然情况下的 142 aa 分别减少到72 aa 和69 aa，说明这些突变很可能会 导致敲除动物 CST3 蛋白质功能的丧失。

用与Cst3基因一致的方法制作Apoa2基因敲除长爪沙鼠，结果显示Apoa2-E2-1与Cas9 蛋白质共注射到受精卵中后一共获得了55只Apoa2 敲除F0代沙鼠，其中17 只显示Apoa2基因编辑成功，敲除成功率为30.9%。 对F0代沙鼠的靶位点进行PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳，这些提示我们成功获得了Apoa2 杂合缺失长爪沙鼠。进一步对F0 代沙鼠靶基因进行TA 克隆测序，测序结果表明我们获得了不同基因型的Apoa2 基因敲除长爪沙鼠。此外，我们预测了Apoa2基因不同缺失类型的蛋白质表达序列，结果显示除15 bp缺失类型仅发生5 aa的缺失以外，其余基因突变类型均会导致翻译的提前终止或移码突变，产生仅有野生型APOA2 蛋白质前40 aa的序列，或在40 aa 后产生非APOA2 氨基酸序列，这提示大部分Apoa2 基因敲除沙鼠可能会导致APOA2 蛋白质功能的丧失。

3. Cst3 -KO沙鼠的脑缺血沙鼠的严重脑损伤

本文中，为了验证Cst3 -KO沙鼠中CST3的功能缺陷并评估CST3在中风中的作用，我们结扎了沙鼠的单侧颈动脉，通过TTC染色法对脑梗塞区域进行检测，Cst3- KO沙鼠（23.2±1.91％）显著大于WT沙鼠（15.6±1.75％）。CST3缺乏还会加剧神经功能缺损，并严重损害前肢的抓地力。另一方面，Cst3敲除并没有影响沙鼠的体重以及PCoA和ACA的解剖模式。因此，我们的数据表明CST3在Cst3- KO沙鼠中功能缺陷，并且CST3对脑缺血具有脑保护作用。

长爪沙鼠作为多种研究方向的优势实验动物，其试验研究有待进一步开发。斯贝福生物引入长爪沙鼠并完成了封闭群和近交系的扩繁，目前已能够为科技研发作规模化供应。欢迎各位科研工作者来电垂询。

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